Maestría Académica en Ciencias Agrícolas y Recursos Naturales con énfasis en Biotecnología
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Ítem Inducción de embriogénesis somática en hipocótilos del híbrido costarricense de papaya (Carica papaya L.): Pococí(2010) Sánchez Chiang, Neiva Diana; Jiménez García, Víctor ManuelLa Universidad de Costa Rica (UCR) y el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) han trabajado en el mejoramiento genético de papaya (Carica papaya), donde ya se ha generado su primer híbrido comercial Pococí . Este híbrido produce 50% de plantas hermafroditas y 50% de plantas femeninas, de las cuales, para su comercialización se prefieren las frutas provenientes de plantas hermafroditas por su forma alargada. Para tratar de cultivar solo plantas hermafroditas, los productores siembran tres plantas por sitio y esperan alrededor de tres meses hasta que el fenotipo de cada planta pueda ser distinguido para eliminar las plantas femeninas. Esto constituye un gasto en mano de obra, fertilizantes y agroquímicos, así como de espacio de siembra en plantas femeninas con menor valor comercial. Una solución para la obtención y propagación únicamente de plantas hermafroditas del híbrido Pococí es la embriogénesis somática. La embriogénesis somática se caracteriza porque involucra el paso por una serie de estructuras similares a las observadas en la embriogénesis cigótica, producto de la fusión de los gametos, pero sin que esto ocurra, y las plantas derivadas por este proceso son idénticas a la planta madre. Este proceso permitiría la propagación clonal de plantas hermafroditas y obviar la siembra de tres plantas por sitio. Además, estos embriones se pueden encapsular con una cubierta protectora para formar semillas artificiales o sintéticas. Para realizar la inducción de embriogénesis somática in vitro, primero se estableció un método eficiente de desinfección de las semillas y fruto de papaya para su introducción y germinación in vitro. Para ello, se evaluó la desinfección de semillas del híbrido de papaya Pococí almacenadas en condiciones no asépticas con diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio (NaOCl) y el producto antimicrobiano Plant Preservative Mixture (PPM) en combinación con diferentes...Ítem Aislamiento, purificación y cultivo de protoplastos en Guadua Angustifolia Kunth (Poaceae: Bambusoideae)(2014) Holst Sanjuán, Andrea; Jiménez García, Víctor ManuelEl gran interés comercial que existe para la Guadua angustifolia ha creado la necesidad de diseñar estrategias para generar cultivares mejorados. Los problemas asociados a la propagación de esta especie hacen de los protoplastos una alternativa interesante para su mejoramiento genético. Para ello, se indujo la formación de callo a partir de segmento s basales de brotes jóvenes y puntas de raíz de plantas de G. angustifolia establecidas in vitro. Se utilizó los reguladores de crecimiento ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) a O, 3 y 6 mg/I y 2,4-D a 3 mg/I en combinación con tidiazurón (TDZ) a 0,01 mg/I; todos los explantes se mantuvieron en oscuridad. El tratamiento en que más e x plantes desarrollaron callo fue el de 2,4-D a 6 mg/I, tanto para brotes jóvenes (92%), como para puntas de raíz (76%) . Los callos obtenidos a partir de segmentos de brote fueron 100% blancos y en su mayoría friables, con excepción del tr atamiento 2,4-D+ TDZ en el cual el 50% de los callos fue de color café y el 100% de ellos tuvo apariencia nodular. Por otro lado, el 100% de los callos formados a partir de las puntas de raíz en todos los tratamientos fue blanco y en su mayoría con apariencia nodular . Los callos formados se transfirieron a medios de crecimiento, de los cuales ú nicamente los adicionados con sólo 2,4-D presentaron crecimiento. El tratamiento con 1O mg/I de 2,4-D mostró la menor oxidación a los tres meses de cultivo. A partir de los callos formados de segmentos de brote, se establecieron suspensiones celulares en 2,4-D a 1O mg/1. Se obtuvo un incremento de 250% en el volumen de células compactas (VCC) en los primeros 15 días de cultivo. Se realizaron varias pruebas para aislar protoplastos a partir de hojas tanto de invernadero como de plantas establecidas in vitro, así como de los callos y suspensiones celulares previamente formadas. No se logró obtener protoplastos...Ítem Aislamiento, cultivo y fusión de protoplastos en dos especies de vainilla (Vanilla planifolia y Vanilla pompona)(2009) Montero Carmona, Wayner; Jiménez García, Víctor ManuelEste trabajo evaluó diferentes factores relacionados con el aislamiento, cultivo y fusión de protoplastos de vainilla (Vanilla planífolía G Jackson y Vanilla pompona Schiede) a partir de explantes de hoja (trozos de 0,3 x 0,3 cm) y protocormos {PLBs). Se estandarizó un pretratamiento de tres semanas en oscuridad previo a colocar los explantes en la solución osmótica (0,06 M de ácido 2-N-morfolinetanosulfónico, MES, y 0,4 M de manito!, pH 5,7) por una hora. Posteriormente, se sustituyó dicha solución con una solución enzimática (0,01 M de MES, 0,7 M de manitol, 1% de celulasa, 1% pectoliasa y 0,5% hemicelulasa a pH 5,7) por tres horas a 28 ºC. Ambos procesos se realizaron en oscuridad a 50 rpm. Los protoplastos aislados fueron filtrados (320 mesh), centrifugados y resuspendidos en una solución de sacarosa 0,6 M. Luego se agregó 1 mide solución de lavado (sales MS al 50% con 0,03 M de MES y 0,2 M de manitol a pH 5, 7) para separar por flotación-centrifugación los protoplastos viables. Se realizaron tres lavados (con centrifugaciones a 100 x g durante 5 min). La viabilidad de los protoplastos se evaluó mediante tinción con azul de Evans al 0,01%. Se obtuvieron rendimientos de 2,9x10s ± 0,7x10s protoplastos/g de tejido para explantes de hoja (viabilidad 81%) y de PLBs (viabilidad 80%) de V. p/anífolía. En V. pompona, los rendimientos obtenidos fueron de 2,8x1 as ± 0,8x1 as y 2,5x1 as± 0,8x1 as protoplastos/g de tejido para explantes de hoja (viabilidad 79%) y de PLBs (viabilidad 79%), respectivamente. Para las pruebas de fusión química, la solución de lavado suplementada con 100 mM de Ca 2 + y polietilenglicol (PEG 8 000) al 30% presentó el mayor número de eventos de fusión (eficiencia 15%). Para las pruebas de electrofusión, la solución hipoosmolar (Eppendort®, HA, AL) con los parámetros de fusión O (U1= 7,5 V, 45 s; Un= 170 V, 30 ¿s - 3; U 2 = 7,5 V, 45 s) mostro...Ítem Clonación y expresión del gen cryXA de la cepa Bacillus thuringiensis serovar israelensis, que codifica delta-endotoxinas con potencial para el control de insectos de importancia económica(2006) Hernández Soto, Alejandro; Espinoza Esquivel, Ana Mercedes; Ibarra Rendón, Jorge EugenioÍtem Descripción sistemática de accesiones de Xanthosoma Schott recolectadas en Costa Rica y cultivo in vitro de las especies silvestres(2013) Chacón Jiménez, José Guillermo; Saborío Pozuelo, Francisco JoséEl tiquizque es un cultivo originario de América perteneciente al género Xanthosoma Schott (Araceae) que fue dispersado por los trópicos del mundo. En la actualidad es consumido de millones de personas. Su producción es afectada por diversos factores limitantes, como la falta de variedades mejoradas o tolerantes a enfermedades, tales como el Potyvirus del mosaico del dasheen o el Mal Seco, producido por el oomicete Pythium miryotilum pv. aracearum. Para resolver estas limitaciones, una de las opciones más promisorias es el mejoramiento genético utilizando variedades silvestres que tengan las características deseadas. Para esto es necesario conocer, recolectar y conservar los recursos genéticos de Xanthosoma. El objetivo general de este trabajo fue recolectar y describir sistemáticamente (con parámetros morfológicos) accesiones silvestres y cultivadas del género Xanthosoma Schott de Costa Rica, y establecerlas in vitro. Se realizó 22 recolectas de materiales cultivados y 20 recolectas de plantas silvestres. Para comparar se incluyeron en el estudio 16 accesiones de bancos de germoplasma internacionales y dos mutantes por irradiación. Estas plantas se micropropagaron in vitro con una metodología para tiquizque blanco y se sembraron en 10 plantas por accesión en bolsas y 20 plantas en campo abierto. Las plantas en bolsas se les aplicó AG3 para inducir su floración para su descripción morfológica. Además, se describió la morfología vegetativa de los materiales sembrados en campo y la floral de algunas accesiones que florecieron de manera natural. Las plantas inducidas con AG3 florecieron irregularmente y las inflorescencias fueron secas y deformes. Los análisis taxonómicos y estadísticos multivariados mostraron la alta diversidad disponible e indican que las formas del tiquizque denominadas moradas, tanto silvestres como cultivadas, pertenecen a la especie X. mafaffa, mientras que las formas blancas a X. robustum. Tres formas...Ítem Determinación de la concentración de hidroximetilfurfural en suspensiones celulares de psychotria parvifolia benth bajo diferentes condiciones de cultivo(2012) Rojas Vargas, Alejandra; Romero Chacón, Rosaura MaríaSe desarrolló un protocolo para el establecimiento in vitro de la especie Psychotria parvifolia. El interés particular para el estudio de esta planta fue debido a que se detectó la presencia de 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) en sus cultivos de células en suspensión. El 5-HMF es un precursor en la síntesis de plásticos y químicos finos. Sin embargo, el uso industrial del 5-HMF tiene como limitante su alto costo de producción. La mejor metodología de desinfección para las semillas (tratamiento E) presentó un 69,2% de explantes libres de contaminación. El porcentaje de germinación de las semillas fue de un 17,54% y el desarrollo completo de la plántula con su parte apical y radical tardó cuatro meses. La mayor formación de callo friable, un 33,33%, se obtuvo en el medio de cultivo MS (Murashige y Skoog) suplementado con ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-0, 1 mg/I) y cinetina (O ,1 mg/I). Mediante un análisis químico utilizando cromatografía de gases acoplada a espectrómetro de masas (GC-MS) se identificaron 15 compuestos, tanto en las vitroplantas como en las suspensiones celulares. Los compuestos mayoritarios en las vitroplantas fueron el ácido palmítico, el neoditadieno y el 5-hidroximetilfurfural, mientras que para las células en suspensión, el 5-hidroximetilfurfural, el ácido palmítico y el fitol.Ítem Aislamiento de Xylella fastidiosa de Citrus sinensis (L) Osb. y vitis vinifera y estudio de su diversidad genética en Costa Rica(2007) Aguilar Álvarez, Estela Yamileth; Rivera Herrero, CarmenXylella fastidiosa es una bacteria patógena de plantas que causa enfermedades en diferentes cultivos de importancia económica. En 1987, en Brasil, se describió la clorosis variegada de los cítricos (CVC), una de las enfermedades más importantes causada por X fastidiosa que afecta árboles de naranja dulce [Citrus sinensis (L.) Osbeck], y provoca pérdidas económicas millonarias. En Costa Rica, en el año 2002, síntomas similares a los causados por CVC fueron observados en árboles de naranja dulce usados como sombra en plantaciones de café y como cercas que delimitan linderos. Un total de 35 de estos árboles de cítricos y 24 de vid, procedentes de ocho y 3 diferentes distritos respectivamente se evaluaron por double antibody sandwich enzyrne-linked irnrnunosorbent assay (DAS- ELISA) resultando 21 de cítricos y 19 de vid positivos. A partir de cuatro de estos árboles de cítricos y seis de vid, se obtuvieron seis aislados y siete aislados respectivamente en medio sólido, cuyas características morfológicas y bioquímicas coincidieron con las informadas en la literatura como propias de X fastidiosa. La identidad de estos aislados se comprobó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los imprimadores 272-1/272-2int y RST31/RST33. Únicamente a partir de tres aislados de Grecia (provincia de Alajuela) se logró amplificar una banda de 500pb al utilizar los imprimadores 272-2int/CVC-l que son específicos para cepas de X fastidiosa que causan CVC. La variabilidad genética de estos aislados entre sí y en comparación con aislados de café de Costa Rica, vid de Estados Unidos y cítricos de Brasil se estudió utilizando las técnicas de polimorfismo de la amplificación aleatoria de ADN (RAPDs) y de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLPs) de los productos obtenidos con los imprimadores JB-1 /JB-2 y 272-1 int/272-2int. Los resultados obtenidos mostraron una clara separación...Ítem Desarrollo de protocolo para la inducción de mutaciones con etil metano sulfonato y azida de sodio en arroz (Oryza satina L.)(2016) Montes de Oca Vásquez, María Gabriela; Azofeifa Delgado, Álvaro AlonsoEl arroz (Oriza sativa L.) constituye un alimento básico para más de la mitad de la población. Debido a su importancia económica existe mucho interés en su mejora genética. Uno de los métodos utilizados para este fin es la inducción de mutaciones con agentes químicos. Entre ellos el etil metano sulfonato (EMS) y la azida de sodio (NaN 3) constituyen agentes muy utilizados en diversas variedades de arroz. En Costa Rica, la variedad de arroz CR-5272 es una de las de mayor importancia comercial, posee buenas características agronómicas; sin embargo, presenta algunas limitantes en su producción. La presente investigación tuvo como objetivos, desarrollar un protocolo para inducir mutaciones con EMS y NaN 3 en el cv. CR-5272 en condiciones de cultivo in vitro e invernadero. Para esto, se desarrolló el establecimiento in vitro utilizando semillas con y sin granza. Para los protocolos de inducción de mutaciones, se trataron con EMS semillas en granza con las concentraciones de O; 0,025; 0,05 ; 0,075 y 0,1 M, preparadas en buffer fosfato de sodio 0,1 M pH 7, con tiempos de exposición de 2, 4 y 6 horas, así como de NaN 3 con las concentraciones de 0; 0,001 ; 0,003 ; 0,005 y 0,007 M, preparadas en buffer fosfato de sodio 0,1 M pH 3, aplicados durante 2 momentos del afio, un experimento se aplicó durante 2, 4 y 6 h de exposición de NaN 3 y otro experimento durante 24, 48 y 72 h de exposición. Se calculó la dosis media de afectación (DA50), tomando en cuenta las variables germinación, longitud del tallo y raíz. Además, se determinó la frecuencia de variantes clorofilicas (FV), la efectividad y eficiencia mutagénica. Según los resultados obtenidos, semillas en granza fueron desinfectadas en más del 85% con todas las concentraciones aplicadas de hipoclorito de sodio (NaOCl) con un tiempo de exposición de 6 h, obtuviendose una germinación mayor al 85%. El medio Linsmaier y Skoog (LS) fue el que produjo mayor número de brotes axilares...Ítem Estudio de genes relacionados con el proceso de floración en plantas de Pitahaya (Hylocereus SP.)(2018) Solórzano Cascante, Paúl; Jiménez García, Víctor ManuelSe realizó un estudio anatómico del desarrollo inicial de los botones florales de pitahaya iniciando con yemas dormantes hasta botones florales de 30 mm de longitud. El desarrollo inicial de las flores de pitahaya (2.5 mm) se caracterizó por la formación de conexiones vasculares desde la yema hacia el interior del tallo, así como, la diferenciación de bractéolas y el pericarpo. En botones florales con longitudes de entre 6 y 10 mm se observó la expansión del tejido vascular, el pericarpo y las bracteólas. A una longitud del botón floral de 12 mm se observaron los órganos masculinos y femeninos en sus etapas iniciales de desarrollo. Los botones florales con 30 mm de longitud presentaron estambres en los cuales se observaron estructuras similares a sacos polínicos. Además, se logró identificar el estigma, el estilo y estructuras similares a rudimentos seminales dentro de una cavidad (posible ovario) ubicada sobre el pericarpo. Los tejidos vasculares de la base del botón floral estaban rodeados por fibras. Las secciones de brote estaban compuestas por una cutícula gruesa en et exterior del brote seguido de ta epidermis, en la que se observaron cristales y estomas, una región de clorénquima y de parénquima. En este último tejido se observaron idioblastos, estructuras intracelulares, en donde se almacenó mucílago y tejidos vasculares desorganizados. Además, se evaluaron siete protocolos de extracción con et fin de eliminar el mucílago durante el proceso y obtener ARN de buena calidad. Los protocolos evaluados se caracterizan por utilizar el uso de columnas de sílica o soluciones buffer con los detergentes dodecil sulfato de sodio, bromuro de cetiltrimetilamonio, TRI REAGENT o isotiocianato de guanidina durante para la lisis celular. El mucílago se logró remover independientemente del tejido muestreado al utilizar una solución buffer Tri con polietilenglicol 20000 al 8% p/v en un primer paso y luego se continuo...Ítem Evaluación de variación somaclonal de plantas de Pitahaya (Hylocereus costaricensis) regeneradas in vitro(2018) Hernández Pridybailo, Andrés; Jiménez García, Víctor ManuelLa pitahaya morada (Hylocereus costaricensis) es un cactus hemi-epífito con potencial agronómico en Costa Rica debido a sus frutos globosos. No se encontraron reportes de evaluación de variación somacional de pitahaya, lo cual permitiría analizar la homogeneidad de poblaciones clonales. Es por ello que se evaluó el nivel de variación somacional de plantas de pitahaya de las variedades Orejona y Cebra regeneradas in vitro por medio de vías directa e indirecta, desde el punto de vista morfológico, epigenético y citológico. Para regenerar plantas por vía directa a partir de la inducción de yemas preformadas, se tomaron explantes de plantas de pitahaya en condiciones de invernadero, de las dos variedades mencionadas y, se agregó la variedad San Ignacio al estudio. Dichos explantes fueron establecidos in vitro en un medio MS sin reguladores de crecimiento, para posteriormente tomar un segmento de cladodio de cada variedad e inducir su brotación por medio del uso de reguladores de crecimiento. De cada explante inducido, se tomó cada cladodio nuevo y se colocó en medio MS sin reguladores para favorecer su formación de biomasa y realizar las evaluaciones. En cuanto a la regeneración de plantas por vía indirecta, solamente se logró la inducción de callos (sin brotes) en las variedades San Ignacio y Orejona, los cuales fueron estudiados histológica y epigenéticamente. El análisis contempló comparaciones considerando el origen del explante (invernadero, in vitro con y sin reguladores de crecimiento) y a cada individuo regenerado. Para detectar posibles cambios a nivel morfológico, se evaluaron 17 variables morfométricas con la ayuda de inspección visual y uso de imágenes digitales. En cuanto a la evaluación epigenética, se cuantificaron los niveles de metilación global del ADN genómico y, el método de amplificación sensible a metilación de ínter-secuencias simples repetidas. Por último, para la detección...Ítem Evaluación de la susceptibilidad de genotipos de café (coffea spp) al hongo Mycena Citricolor y determinación de genes candidatos de defensa(2012) Echeverría Beirute, Fabián; Gómez Alpízar, Luis EnriqueEn Costa Rica, la presencia del hongo Mycena citricolor en las plantaciones de cate (Coffea arabica) ha reducido el rendimiento y elevado los costos de producción. Debido a ello, la resistencia genética es la mejor opción para el combate de esta enfermedad. Se evaluó en laboratorio la susceptibilidad de 33 accesiones de café pertenecientes a 9 especies del género Coffea, ante una cepa altamente patogénica de Mycena citricolor previamente aislada y cultivada in vitro. En la prueba de patogenicidad, se determinó a los 4, 7 y 1O Días Después de Inoculación (DDI) el porcentaje de lesiones por hoja y lesiones que esporularon, y a los 1O DDI, el diámetro de lesión. Se obtuvo un 100% de incidencia en los genotipos de C. arabica a los 4 DDI, mientras menos de W1 55% para C. c an ephora. La esporulación en nuevas lesiones se manifestó posterior a los 7 DDI, especialmente en genotipos de C. arabica. El diámetro de las lesiones fue mayor para C. eugenioid es y menor para C. canephora, C. congensis y C. arabica. Ningún genotipo mostró resistencia al patógeno, aunque hubo diferentes respuestas ante la exposición del hongo. Poste1ior a dichos análisis de patogenicidad, se seleccionaron 22 genotipos con variable nivel de susceptibilidad, extrajo el ADN y analizaron molecularmente mediante PCR ante 12 pares de in1Primadores conservados para genes de resistencia análogos con motivos NBS y LRR, además de oxalato oxidasa y otras enzimas involucradas en procesos de resistencia a patógenos. Se obtuvo un nivel variable de polimorfismo desde O a 67 % para 9 pares de los imprimadores. No se detectaron bandas de tamaño exacto a las reportadas en la literatura para otros cultivos; aunque 16 fragmentos podrían estar asociadas a la tolerancia o susceptibilidad al patógeno, constituyéndose como posibles marcadores moleculares de resistencia. Futuros análisis de las secuencias obtenidas y comparación en bases de datos podrían determinar...