Examinando por Autor "Chaves Olarte, Esteban"
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Ítem Análisis y caracterización del tránsito intracelular de Brucella canis en células epiteliales HeLa durante diferentes tiempos de infección(2015) Wong Araya, Melissa; Chaves Olarte, EstebanReportes científicos previos sugieren que Brucella canis es incapaz de replicarse intracelularmente, esto se adjudica en parte a su condición rugosa. En el presente estudio se encontró que además de replicarse intracelularmente, realiza un ciclo intracelular de infección similar al de la especie lisa Brucella abortus; lo que parece indicar que el antígeno O del lipopolisacárido no es esencial para la replicación intracelular. Para hacer estos hallazgos se infectaron células epiteliales HeLa con ambas bacterias a una MOI de 500, y se utilizaron anticuerpos contra marcadores de superficie de Retículo Endoplásmico y autofagosomas para analizar la co- localización de las bacterias en los mismos, y determinar así la vía de tráfico intracelular durante la infección. Las monocapas celulares infectadas se analizaron mediante microscopía de fluorescencia y confocal a diferentes tiempos de infección.Ítem Caracterización proteómica de los compartimentos intracelulares tempranos de macrófagos RAW 264.7 en los que transitan dos cepas de Brucella abortus utilizando la plataforma del Instituto Clodomiro Picado y comparación con los resultados obtenidos en una plataforma distinta en trabajos anteriores(2023) Martínez Calderón, Carlos Josué; Chaves Olarte, EstebanBrucella sp. es una α2-Proteobacteria intracelular causante de infecciones en humanos y animales. Mundialmente al año se presentan 500 000 nuevos casos de brucelosis en humanos, específicamente en Costa Rica del 2003 al 2015 se reportaron 124 pacientes afectados por este agente. Además, las infecciones en ganado bovino repercuten en la industria ganadera al limitar la producción de leche. Durante el proceso de infección Brucella spp. produce cambios en el tráfico intracelular para evitar su eliminación en el lisosoma, finalizando en el retículo endoplasmático; a través de toda esta vía la bacteria modula el entorno a través de diferentes factores de virulencia. Se propone que B. abortus modifica proteómicamente los compartimentos que ocupa en el interior de los macrófagos RAW 264.7 por medio del sistema de secreción VirB. Para comprobar esto se aislaron las vacuolas de macrófagos infectados por B. abortus silvestre y una cepa mutante de VirB a través de un método de ultracentrifugación empleando un gradiente de sacarosa. Se realizó una extracción proteica de dichas vacuolas para finalmente concretar una comparación de la composición proteómica entre ambas. Se utilizó la cepa virB10- como control y el enfoque permitió identificar las proteínas que difieren entre los compartimentos y que tienen un alto poder discriminatorio en el análisis y una relevancia biológica. Para determinar qué proteínas caracterizan exclusivamente los compartimentos contenedores de las cepas 2308W o virB10-, se compararon las listas de proteínas obtenidas y se evaluó su importancia biológica. En este estudio, se implementó un protocolo de enriquecimiento de las vacuolas durante las primeras etapas de infección en macrófagos murinos RAW 264.7. También se compararon las proteínas resultantes de análisis HPLC- MS/MS en cepas diferentes para destacar las diferencias a nivel cualitativo y cuantitativo de los compartimentos intracelulares a las 4...Ítem Desarrollo de herramientas para el estudio de los mecanismos de virulencia de Brucella abortus(2003) Grijalba Murillo, Muriel; Jensen Gamboa, Evan Bjorck; Chaves Olarte, EstebanSe pretende estudiar la expresión de las proteínas del sistema de dos componentes BvrR-BvrS y de proteínas bajo el control del mismo utilizando anticuerpos específicos. Se sintetizaron dos péptidos el primero correspondiente a una secuencia del sensor BvrS que presentaba alta antigenicidad y homología con otras proteínas sensoras y el segundo correspondiente a una secuencia de la proteína de membrana extema Omp3b, mediante técnica manual en fase sólida utilizando la estrategia F-moc, éstos fueron analizados mediante HPLC. Se inmunizO un conejo con el péptido BvrS para obtener un suero policlonal y posteriormente se purificaron los anticuerpos mediante cromatografia de afinidad. Finalmente se realizo Westem blot de lisados celulares de B. abortus utilizando los anticuerpos anti-BvrS. El análisis del Westem blot indicó que los anticuerpos policlonales anti- BvrS detectaron bandas proteicas cercanas a los 60KDa en los lisados celulares de B. abortus cepa silvestre 2308 y cepa rugosa PerA. El peso molecular esperado para el sensor BvrS es de aproximadamente 66KD, por lo que es probable que los anti - BvrS producidos estén reconociendo al sensor. Los anticuerpos no detectaron ninguna banda proteica en la cepa mutante 2.13 que carece de bvrs y que se incluyó como control negativo, lo mismo sucedió con el lisado celular de la cepa 2.13 que fue reconstituida con el sensor ExoS de S .melitoti donde los anticuerpos anti-BvrS no fueron capaces de reconocer ninguna proteína. Se esperaba un reconocimiento por reacción cruzada de los anticuerpos anti-BvrS contra el sensor ExoS expresado en la cepa 2.13 reconstituida dado el alto grado de homología, sin embargo pareciera que el cambio de tres residuos de aminoácidos en la secuencia fue suficiente para variar las propiedades antigénicas del péptido del sensor BvrS con respecto a las propiedades del sensor ExoS. Con esta herramienta se...Ítem Determinación de la habilidad de Brucella canis para multiplicarse intracelularmente en células fagocíticas(2015) Kellerman Montero, Karina; Chaves Olarte, EstebanLa brucelosis es una enfermedad zoonótica causada por las bacterias del género Brucella. Se transmite por contacto causando un cuadro febril. Dentro del género se encuentran 4 especies patógenas para el ser humano: B. melitensis, B. suis, B. abortus y B. canis. Su patogénesis está ligada íntimamente a la habilidad de la bacteria para multiplicarse intracelularmente, transitando a través de su citoplasma y evadiendo la ruta lisosomal, para llegar al retículo endoplásmico, donde se multiplica en grandes cantidades. Muchos factores de virulencia como lipopolisacárido (LPS), sistema de secreción tipo IV (T4SS) y el sistema de dos componentes BvrR/BvrS, se han identificado por ser críticos en el proceso de vida intracelular de la bacteria en macrófagos. Para B. canis, una bacteria rugosa, la ruta de entrada es desconocida, por lo que se sugiere que utiliza diferentes vías y utiliza diferentes compartimentos intracelulares requiriendo de distintas estrategias de sobrevivencia. A partir de esto surge la incógnita de determinar si realmente esta especie, es una bacteria intracelular, con el fin de abrir una brecha para la cual se puedan conocer y estudiar los factores de virulencia y los mecanismos de infección que le permiten producir enfermedad. Se observó una disminución en la cantidad de bacterias viables recuperadas de las células infectadas cuando el inóculo provenía de condiciones crecidas en Erlenmeyer con mayor oxigenación. Por el contrario, cuando el inóculo provino de bacterias crecidas en tubo cónico, con menor oxigenación, se pudo evidenciar una multiplicación intracelular evidente con un aumento de 100 veces en la cantidad de bacterias recuperadas entre el tiempo 0 y el tiempo 48 horas.Ítem Panel de Gtpasas glicosiladas por diferentes TcdBs de Clostridium difficile y su relación con el potencial patogénico de distintas cepas(2016) López Ureña, Diana; Chaves Olarte, EstebanEstudios recientes han demostrado que TcdB es el principal factor de virulencia de Clostridium difficile y que las variaciones en virulencia que se presentan entre las distintas cepas, podrían estar relacionado con esta toxina, tal como en el caso de la cepa epidémica NAP1 y las cepas que presentan una TcdB variante, Sin embargo, no se conoce con exac titud cuál es el papel que tienen estas distintas TcdBs sobre el potencial1 patógeno de las cepas. Por tanto, en este trabajo se analizaron cuatro toxinas distintas (TcdBNAP1, TcdBNAP1v , TcdBNAP9 y TcdBvpI10453) con el fin de dilucidar el papel del panel de sustratos modificados por estas proteínas en la patogénesis de C. difficíle. Por medio de ensayos de glicosilación se determinó el espectro de GTPasas modificadas, y se determinaron los efectos celulares inducidas por las distintas TcdBs en términos de efecto citopático (CPE), muerte celular y activación inmune. Asimismo , se evaluó el potencial patogénico asociada a cada TcdB. por medio del ensayo de asa ligada en ratón. Por medio de ensayos in vítro y ex vívo se determinó que TcdBNAP1 es capaz de glicosilar un panel más amplio de sustratos. Esta toxina es capaz de glicosilar a las GTPasas Rho y Ras, mientras que TcdBvP10463 sólo modifica a RhoA, Rac1 y Cdcd42, y TcdBNAP1v y TcdBNAP9 glicosilan a Rac1 y R-Ras. Una comparación de la cinética de estas proteínas en distintas líneas. celulares ireveló die manera indirecta, que la tasa de entrada a las células eucariotas es similar para todas las toxinas a pesar de que sólo TcdBNAP1 y TcdBNAP1v comparten los dominios de unión al receptor y de autoprocesamiento. En cambio, el tipo de CPE causado por cada toxina seasocia a un dominio glicosiltransferasa (GTD) similar. Aunado a esto, los eventos biologicos asociados a la intoxicación parecen relacionarse con el pane de sustratos...Ítem Producción de anticuerpos contra la proteína reguladora del sistema de dos componentes BvrR/BvrS de Brucella abortus para el estudio de su papel en la virulencia(2004) Herrera Rodríguez, Fabiola; Chaves Olarte, EstebanBrucella abortus es un exitoso patógeno intracelular, cuyos mecanismos de virulencia no han sido completamente dilucidados. La bacteria posee un sistema de dos componentes (BvrR/BvrS), que juega un papel importante en la invasión y sobrevida intracelular, al regular la expresión de proteínas de membrana y la acilación del lipido A. El sistema está compuesto por una proteína sensora periplásmica y una proteína reguladora citoplasmática, y como respuesta a ciertos estimulos es activado por medio de fosforilaciones. En esta investigación se desarrollaron anticuerpos contra la proteína reguladora BvrR del sistema, que fueron utilizados para estudiar la expresión de dicha proteína en diferentes cepas de B. abortus y en bacterias filogenéticamente relacionadas; así como también su patrón de fosforilación. Mediante análisis por Western Blot, no se observó variación en la expresión de la proteína BvrR en cepas de B. abortus de fenotipo liso y rugoso. En la mutante B. abortus bvrS la expresión de la proteína siempre fue menor, sugiriendo que la presencia de la misma está relacionada de alguna manera con la expresión de la proteína reguladora BvrR. Por otro lado, la reacción cruzada de los anticuerpos anti BvrR con la proteína Chvl de S. meliloti y el reconocimiento de una proteína de peso molecular similar a la proteína reguladora en O. anthropi, confirman la estrecha relación filogenética de estas bacterias con B. abortus. Los anticuerpos elaborados en la presente investigación mostraron ser una útil herramienta para el estudio del funcionamiento del sistema de dos componentes de B. abortus. A la vez, pueden ser empleados en investigaciones futuras para lograr una mejor comprensión de la virulencia de este patógeno.